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癌癥研究中方興未艾的免疫治療的思路主要包括免疫檢查點(diǎn)治療和細(xì)胞治療。這兩種思路是從提高免疫細(xì)胞功能的角度出發(fā)，為患者輸注藥物去增加免疫力。能不能從相反的角度出發(fā)，對(duì)于一些影響免疫力的蛋白做一些“減法”治療，即去除這些蛋白。這種藥物研發(fā)在之前是難以實(shí)現(xiàn)的，或者說(shuō)是“難以成藥” 。但隨著一些新的藥物研發(fā)策略的興起，使這些蛋白有望成為新的靶點(diǎn)。
南京醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科殷詠梅副院長(zhǎng)團(tuán)隊(duì)成員與西北大學(xué)芬伯格醫(yī)學(xué)院羅伯特·盧里綜合癌癥中心的研究者剛剛在《Science Advances》雜志（影響因子：14.957）上發(fā)表了一篇題為“Proteolytic Regulation of CD73 Orchestrates Tumor Immunogenicity”（調(diào)控CD73的蛋白水解可調(diào)節(jié)腫瘤免疫原性）的論文給出了新的腫瘤治療思路。文章提到，乳腺癌是導(dǎo)致婦女癌癥死亡的第二大原因，對(duì)于女性的健康造成很大的威脅。其中三陰性乳腺癌（TNBC）被認(rèn)為是一種“冷腫瘤”，對(duì)其治療選擇較少，也是侵襲性的乳腺癌形式，導(dǎo)致患者預(yù)后不良。在乳腺癌治療靶點(diǎn)的選擇上，除了免疫檢查點(diǎn)外，還存在CD73這類(lèi)與腫瘤微環(huán)境免疫功能相關(guān)的蛋白。高水平的CD73與較差的預(yù)后相對(duì)應(yīng)。與此同時(shí)，三結(jié)構(gòu)域（TRIM）蛋白也與免疫調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生有關(guān)。TRIM蛋白本質(zhì)上是蛋白質(zhì)降解途徑的一部分，在其中它們發(fā)出某些蛋白質(zhì)的降解信號(hào)。先前的研究表明，TRIM21水平與疾病進(jìn)展相對(duì)應(yīng)，但迄今為止，它與癌癥免疫原性的關(guān)聯(lián)仍不清楚。
圖1：TRIM21low/CD73high的特征與不利的免疫反應(yīng)相關(guān)
IsoPlexis（NASDAQ: ISO）公司總部位于美國(guó)的康涅狄格州，是一家專(zhuān)注于單細(xì)胞功能蛋白質(zhì)組分析解決方案的供應(yīng)商。作為單細(xì)胞多組學(xué)的重要組成部分，IsoPlexis單細(xì)胞技術(shù)已被國(guó)內(nèi)外用戶(hù)廣泛認(rèn)可，包括高?？蒲袡C(jī)構(gòu)、全球Top 20的制藥企業(yè)、70%美國(guó)綜合性癌癥中心等，在臨床科研領(lǐng)域，針對(duì)評(píng)估和檢測(cè)人體單細(xì)胞免疫能力、篩選癌癥治療方案、預(yù)測(cè)評(píng)估臨床療效及安全性等方面有著豐富的成功經(jīng)驗(yàn)，為預(yù)測(cè)病人長(zhǎng)期生存、早期篩選治療獲益患者提供了詳實(shí)的參考數(shù)據(jù)，加速藥物研發(fā)上市及聯(lián)合療法開(kāi)發(fā)應(yīng)用。
通過(guò)使用IsoPlexis的檢測(cè)技術(shù)，各地的研究人員在Cell、Nature Medicine、Immunity、Journal of Clinical Oncology、Cancer Cell等高影響力期刊上發(fā)表多篇高分文章，并在腫瘤免疫、細(xì)胞治療、腫瘤學(xué)、抗感染免疫研究及疫苗開(kāi)發(fā)、自身免疫病、移植免疫等方向取得了眾多突破性成果，應(yīng)用于疾病發(fā)病和耐藥性機(jī)制研究、生物工藝優(yōu)化、預(yù)測(cè)及評(píng)估免疫相關(guān)不良反應(yīng)的新型生物標(biāo)志物，助力加速醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)行業(yè)發(fā)展。
研究思路
研究者證實(shí)了CD73的高表達(dá)與所有乳腺癌分類(lèi)中較低的生存率相關(guān)。然后，他們通過(guò)一些分子生物學(xué)技術(shù)揭示了CD73水平經(jīng)歷了一種被稱(chēng)為泛素化的翻譯后修飾。泛素化本質(zhì)上是蛋白質(zhì)的一種降解信號(hào)。通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)合發(fā)現(xiàn)這種蛋白水解信號(hào)的驅(qū)動(dòng)因素是TRIM21。接下來(lái)，鑒定TRIM21作為控制CD73蛋白降解以調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能的潛在泛素E3連接酶。
泛素化的關(guān)鍵是泛素肽附著（或連接）到賴(lài)氨酸殘基上。該小組試圖找出哪些賴(lài)氨酸殘基可能是CD73蛋白被泛素化的賴(lài)氨酸。他們鑒定了以下賴(lài)氨酸作為泛素化位點(diǎn)：K133、K208、K262和K321。為了確定這些賴(lài)氨酸對(duì)TRIM21介導(dǎo)的CD73降解的重要性，作者將這些特定殘基突變?yōu)榫彼幔碚撋蠒?huì)阻斷泛素化，得到多個(gè)突變TNBC細(xì)胞系：MDA-MB468-CD734KR（這4個(gè)賴(lài)氨酸殘基均突變?yōu)榫彼幔?，MDA-MB468-CD73K133R/K208R（K133和K208的賴(lài)氨酸突變?yōu)榫彼幔?，MDA-MB468-CD73K262R/K321R（賴(lài)氨酸K262和K321突變?yōu)榫彼幔?/p>
IsoPlexis檢測(cè)方法
將MDA-MB468-CD73WT或MDA-MB468-CD734KR分別用APCP（CD73抑制劑）或不加APCP處理24小時(shí)，使用腫瘤條件培養(yǎng)基培養(yǎng)。收集突變TNBC細(xì)胞培養(yǎng)上清液。供體PBMCs加入收集的上清液，使用anti-CD3刺激，培養(yǎng)WT/No APCP、4KR/No APCP、WT/APCP或4KR/APCP四組細(xì)胞。在孵育72小時(shí)后，作者評(píng)估了供體PBMC分選的CD8+T細(xì)胞的多功能性和細(xì)胞多功能指數(shù)PSI。
研究者發(fā)現(xiàn)，與WT細(xì)胞的T細(xì)胞相比，加入突變細(xì)胞系培養(yǎng)上清的T細(xì)胞多功能和多功能指數(shù)總體耗盡。并且有趣的是，與未經(jīng)APCP處理的T細(xì)胞相比，經(jīng)APCP處理的T細(xì)胞的多功能性和PSI似乎略有增加（圖2）。
圖2：IsoPlexis檢測(cè)CD73及其泛素化位點(diǎn)突變
對(duì)于免疫細(xì)胞功能的影響
這意味著靶向CD73，通過(guò)增強(qiáng)其降解或簡(jiǎn)單抑制其功能可能是增強(qiáng)免疫功能的可行選擇。他們也進(jìn)行了進(jìn)一步檢測(cè)以明確起關(guān)鍵作用的泛素化位點(diǎn)，培養(yǎng)MDA-MB468-CD73K133R/K208R和MDA-MB468-CD73K262R/K321R（圖3），評(píng)估其培養(yǎng)上清對(duì)于CD8+T細(xì)胞多功能和PSI的影響，結(jié)果顯示，K262和K321突變組的細(xì)胞多功能性和PSI均顯著降低，表明K262和K321是TRIM21介導(dǎo)CD73泛素化降解的關(guān)鍵賴(lài)氨酸位點(diǎn)。
圖3：IsoPlexis檢測(cè)確定起關(guān)鍵作用的泛素化位點(diǎn)
此外，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)用IFN?處理MDA-MB468細(xì)胞時(shí)，TRIM21水平顯著升高，CD73水平顯著降低。這表明，像CD8+T細(xì)胞這樣的IFN?分泌細(xì)胞的存在創(chuàng)造了一個(gè)反饋回路，從而提高腫瘤細(xì)胞中的TRIM21水平，進(jìn)而耗盡CD73水平。最后，本文總結(jié)了小鼠和患者的體內(nèi)數(shù)據(jù)，探討了TRIM21水平如何與小鼠模型腫瘤負(fù)荷和患者更有利的免疫信號(hào)相關(guān)?？傊?，作者闡明了CD73如何促進(jìn)TNBC的免疫逃避的機(jī)制，同時(shí)也揭示了CD73可以通過(guò)TRIM21進(jìn)行調(diào)控的機(jī)制。最終，這些數(shù)據(jù)為靶向CD73以提高免疫療法和其他類(lèi)型的治療方法的有效性提供了一個(gè)案例。
文章點(diǎn)評(píng)
文章點(diǎn)評(píng)
#1
在免疫檢查點(diǎn)治療策略之外，對(duì)付癌癥的“wuqi庫(kù)”永遠(yuǎn)需要新的選項(xiàng)，評(píng)估這些選項(xiàng)的標(biāo)準(zhǔn)是什么？是用了很多年的檢測(cè)方式，還是研究人員比較“熟悉”的一些諸如濃度、成像、亞群等指標(biāo)，抑或是“其他人”也在做的實(shí)驗(yàn)方法。我們認(rèn)為答案是否定的，需要用事實(shí)說(shuō)話，臨床轉(zhuǎn)化研究中的事實(shí)就是能否與臨床結(jié)果建立相關(guān)性，這也是單細(xì)胞蛋白組技術(shù)對(duì)于臨床轉(zhuǎn)化及前期基礎(chǔ)研究的意義。
IsoPlexis平臺(tái)提供了評(píng)估免疫功能的標(biāo)準(zhǔn)，從而更好地確定治療策略是否有效，如為CD73等新靶點(diǎn)評(píng)估提供決定性的根據(jù)。
#2
#3
與免疫檢查點(diǎn)和細(xì)胞治療不同，新的泛素依賴(lài)的藥物研發(fā)路徑使之前“難以成藥”的蛋白成為新的靶點(diǎn)。要評(píng)估蛋白對(duì)于免疫微環(huán)境的影響，需要去檢測(cè)免疫細(xì)胞的免疫功能的變化，需要對(duì)于活的免疫細(xì)胞進(jìn)行刺激，并且避免由于免疫細(xì)胞的功能異質(zhì)性而隱藏的重要信息，所以需要使用單細(xì)胞層面的功能蛋白組檢測(cè)，這使得單細(xì)胞功能蛋白組技術(shù)成為這類(lèi)研究的不二zhixuan！
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